骨科研究所秦昕副教授、姜晴副教授团队在JOT上发表论文

近日，骨科研究所秦昕副教授和姜晴副教授团队的论文“Roles of Sp7 in osteoblasts for the proliferation, differentiation, and osteocyte process formation.”在 骨科专业杂志Journal of Orthopaedic Translation发表。姜晴副教授为论文的第一作者，秦昕副教授和苏州大学讲座教授Toshihisa Komori教授为通讯作者。

Osterix/Sp7是调节成骨细胞分化的重要转录因子，含有三个羧基末端锌指基序，属于SP转录因子家族成员之一。Sp7通过同源盒蛋白（distal-less homeobox, Dlx）结合富含AT序列的Dlx靶标基因以调控基因表达。Sp7基因的种系（Sp7^{− /−}）小鼠完全缺失成骨细胞和骨骼，导致小鼠出生后因呼吸窘迫死亡。既往研究通过对新生小鼠注射他莫昔芬激活CAG-CreER/loxp系统敲除Sp7，引起Sp7敲除小鼠骨形成减少和骨量下降。因此，Sp7在胚胎期和出生后对成骨细胞分化和骨形成至关重要。此外，SP7基因位点与人类骨质疏松症有关，也是罕见的成骨不全的致病位点。然而，Sp7在已分化的成骨细胞中的功能尚不清楚，成骨细胞特异性Sp7缺失对骨细胞的影响尚未得到充分研究。课题组制作了两种小鼠模型，一种是种系敲低Sp7的小鼠模型：Sp7 ^{floxneo/floxneo}小鼠中因neo基因的插入干扰了mRNA剪接，使得Sp7表达降低至野生型小鼠的30%。另一种是使用自制的2.3 kb Col1a1 EGFP-Cre转基因小鼠和Sp7 ^flox/flox小鼠交配获得的成骨细胞特异性敲除Sp7（Sp7^{fl/fl;Col1a1-Cre}）的小鼠。通过对两种小鼠模型分析，我们发现Sp7抑制成骨细胞增殖、促进成骨细胞Col1a1表达、并在成骨细胞向骨细胞转化过程中的细胞突起形成过程中发挥重要作用。骨细胞突起数量减少导致骨细胞凋亡，埋藏在骨基质中凋亡的骨细胞不能及时被清除，导致继发性坏死。凋亡的骨细胞释放ATP，坏死的骨细胞释放DAMPs从而增强了破骨细胞的生成，最终导致股骨皮质骨孔隙严重增大。

课题组制作了两种小鼠模型，一种是种系敲低Sp7的小鼠模型：Sp7 ^{floxneo/floxneo}小鼠中因neo基因的插入干扰了mRNA剪接，使得Sp7表达降低至野生型小鼠的30%。另一种是使用自制的2.3 kb Col1a1 EGFP-Cre转基因小鼠和Sp7 ^flox/flox小鼠交配获得的成骨细胞特异性敲除Sp7（Sp7^{fl/fl;Col1a1-Cre}）的小鼠。通过对两种小鼠模型分析，我们发现Sp7抑制成骨细胞增殖、促进成骨细胞Col1a1表达、并在成骨细胞向骨细胞转化过程中的细胞突起形成过程中发挥重要作用。骨细胞突起数量减少导致骨细胞凋亡，埋藏在骨基质中凋亡的骨细胞不能及时被清除，导致继发性坏死。凋亡的骨细胞释放ATP，坏死的骨细胞释放DAMPs从而增强了破骨细胞的生成，最终导致股骨皮质骨孔隙严重增大。

  

Sp7基因主要包括两个mRNA亚型，I型和II型分别从不同的转录起始位点转录。内含子中插入neo基因干扰了mRNA剪接并降低了I型和II型Sp7表达。Sp7 ^floxneo/+小鼠和Sp7 ^{floxneo/floxneo}小鼠的I型和II型Sp7 mRNA分别约为Sp7^+/+小鼠的60%和30%。

 利用2.3 kb Col1a1 EGFP-Cre转基因小鼠和Sp7^{foxneo/foxneo}小鼠制作了Sp7^{foxneo/foxneo;Col1a1−Cre}小鼠。与各自的对照小鼠相比，雄性Sp7^{floxneo/floxneo;Col1a1−Cre}和雌性Sp7^{floxneo/floxneo}的体重下降。Micro-CT分析显示，与对照组小鼠相比，雄性Sp7^{floxneo/floxneo;Col1a1−Cre}小梁骨数目上升、Sp7^{floxneo/floxneo}和Sp7^{floxneo/floxneo;Col1a1−Cre}小鼠的小梁骨BMD下降。雌性Sp7^{floxneo/floxneo}小鼠的小梁骨骨量和数目上升。雄性Sp7^{floxneo/floxneo}、Sp7^{floxneo/floxneo;Col1a1−Cre}和雌性Sp7^{floxneo/floxneo}小鼠的皮质骨骨量、厚度和BMD下降。未成熟成骨细胞标志基因Spp1、成骨细胞标志基因Tnfsf11（促进破骨细胞分化）、骨细胞标志基因Dmp1和Sost在Sp7^{floxneo/floxneo;Col1a1−Cre}小鼠的成骨细胞和骨细胞中表达下降。

  

通过CAG-Flp转基因小鼠和Sp7^floxneo/+小鼠交配去除neo基因以获得Sp7^flox/+小鼠，再与2.3 kb Col1a1 EGFP-Cre转基因小鼠交配获得Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠。雌性和雄性Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠的体重与对照组相似，雌性Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠股骨的小梁骨骨量、数目上升，BMD下降，而这些指标在雄性Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠没有变化。雄性和雌性Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠股骨的皮质骨骨量、厚度和BMD都显著下降。高分辨率micro-CT分析显示雄性Sp7^{floxneo/floxneo}、Sp7^{floxneo/floxneo;Col1a1−Cre}和Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠股骨的皮质骨出现大量孔洞，并且Sp7^{floxneo/floxneo;Col1a1−Cre}小鼠最为严重。雄性和雌性Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠腰椎骨的骨量等显著下降，血清骨生成标志物P1NP不变，但骨吸收标志物TRAP5b显著上升。

  

骨形态学分析显示Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠胫骨的成骨细胞数目和骨生成显著上升，腰椎骨的成骨细胞数目和骨生成显著下降，股骨皮质骨的骨生成速率无显著变化。

  

细胞增殖标志物BrdU阳性细胞在Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠的小梁骨区域显著上升，细胞凋亡标志物TUNEL阳性骨细胞在Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠的小梁骨和皮质骨都显著上升，但破骨细胞标志物TRAP阳性细胞只在Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠的皮质骨上升。Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠的每个骨细胞的骨细管数目显著下降，导致骨细胞腔管网络系统严重紊乱，骨细胞标志物Sost阳性细胞数目明显下降。

Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠的成骨细胞标志基因Col1a1、Bglap&Bglap2和骨细胞标记基因Dmp1、Sost、Phex、Fgf23、Mepe表达均显著下降。未成熟成骨细胞标志基因Spp1和成骨细胞标志基因Tnfsf11表达上升。有报道发现Ostn是Sp7的靶基因，促进骨细胞突起形成，但在我们的Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠中Ostn表达无明显变化。同时，在成骨细胞过表达Sp7的转基因小鼠的成骨细胞和骨细胞中也无显著变化，体外成骨细胞系MC3T3-E1中过表达Sp7，不能上调Ostn表达。因此，Sp7靶向调控成熟成骨细胞向骨细胞转化过程中突起形成的靶基因仍需要进一步鉴定。

  

在Sp7^fl/fl小鼠中观察到两种Sp7阳性细胞位于骨表面，具有大量细胞质的Sp7阳性立方体成骨细胞在小梁骨和皮质骨与Col1a1抗体发生强烈反应。另一种Sp7阳性含少量细胞质的前成骨细胞位于成骨细胞的骨髓侧，与皮质骨上的成骨细胞区分明显，与Col1a1抗体反应弱。Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠的成骨细胞显示Sp7阴性，成骨细胞呈扁平状态，与Col1a1抗体发生强烈反应。Sp7^fl/fl和Sp7^{flox/flox;Col1a1− Cre}小鼠中扁平的前成骨细胞对抗Sp7抗体的反应相似。说明成骨细胞中敲除Sp7导致Col1a1的含量下降。

2.3 kb Col1a1启动子EGFP- cre转基因小鼠中EGFP的表达反映了内源性Col1a1的表达。成骨细胞中敲除Sp7导致新生小鼠股骨EGFP表达下降。此外，在原代成骨细胞中过表达Sp7可上调Col1a1的表达。这些结果表明，Sp7至少在一定程度上通过调控2.3 kb Col1a1启动子来控制Col1a1的表达。碱性磷酸酶（ALP）和von Kossa染色分别代表成骨细胞分化的早期和晚期。与Sp7^fl/fl小鼠相比，Sp7^{fl/fl;Col1a1−Cre}小鼠ALP染色较强，von Kossa染色较弱，说明Sp7^{fl/fl;Col1a1−Cre}小鼠中未成熟成骨细胞数量增加，成骨细胞成熟受到抑制。将野生型小鼠骨髓来源的单核/巨噬细胞系细胞（BMMs）与Sp7^fl/fl或Sp7^{fl/fl;Col1a1−Cre}小鼠的原代成骨细胞共培养时，Sp7^{fl/fl;Col1a1−Cre}小鼠的多核破骨细胞数量高于Sp7^fl/fl小鼠，骨吸收面积（陷坑面积）也大于Sp7^fl/fl小鼠。这些结果表明，在体外，缺失成骨细胞中Sp7可增加未成熟成骨细胞的数量，抑制成骨细胞成熟，促进破骨细胞的发生。

  

结论： Sp7参与了成骨细胞增殖、成骨细胞成熟、Col1a1的表达和成骨细胞向骨细胞转化过程中突起的形成。成骨细胞成熟受损的代偿机制以及在股骨和椎骨之间以及雄性和雌性之间的差异的分子机制，有待于进一步研究。通过阐明成熟的成骨细胞/骨细胞获得足够数量的细胞突起以维持骨细胞存活，以及机械感应和机械转导的机制在维持骨的量和质量方面具有重要意义。

 

文章题目：Roles of Sp7 in osteoblasts for the proliferation, differentiation, and osteocyte process formation

 

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jot.2024.06.005

标签：细胞  基因  小鼠