基础医学院程凯莹团队解析耐辐射奇球菌DHH/DHHA1家族蛋白的结构与功能

近日，我校基础医学院程凯莹教授课题组采用了遗传学、组学、结构生物学和生物化学等多种分析手段，阐明了耐辐射奇球菌DHH/DHHA1家族中两个成员蛋白的生化和功能特性，为这一蛋白家族参与细菌应激反应过程提供了新的见解。相关成果以题为Structural and functional investigation of the DHH/DHHA1 family proteins in Deinococcus radiodurans发表于国际著名期刊Nucleic Acids Research（IF=16.6）上。

细菌编码多种蛋白质以克服因营养不足、DNA损伤或有害代谢物积累而产生的生存压力。RNA降解在整个RNA代谢过程中起着至关重要的作用，并显著影响细胞内的RNA水平。细胞中核糖核酸酶对RNA的降解通常会产生nanoRNA，即长度从2到5个核苷酸的短RNA片段，而不是完全消化成单核苷酸。冗余的nanoRNA会影响基因表达谱，诱导代谢应激，最终导致细胞死亡。因此，nanoRNA的完全降解对于维持细胞的正常代谢至关重要。细菌中协助完成nanoRNA降解的其中一类蛋白——NrnA，是来自于DHH/DHHA1磷酸酯酶家族。此外，DHH/DHHA1家族蛋白还被认为在细菌抵抗环境压力中扮演关键角色。耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans, Dr）以其对DNA损伤的显著修复能力而闻名，其拥有高效的DNA损伤响应和修复系统。其含有两个DHH/DHHA1家族同源蛋白——DrRecJ和DrRecJ-like。其中，DrRecJ的结构和功能，及其在DNA损伤修复过程中的分子机制已在之前的研究中得到了阐明，而DrRecJ-like蛋白的生化活性、结构特征和生物学功能尚未得到研究。

首先，研究团队构建了两蛋白的单缺失株和双缺失株，发现与野生型菌株（WT）相比，在30℃下，ΔJ-like、ΔJ和ΔJ/J-like有明显的生长缺陷（图1）。有趣的是，在37℃下，DrRecJ-like蛋白的缺失可以部分抑制ΔJ敲除株的生长缺陷。为了研究DrRecJ-like蛋白在应激反应过程中的作用，团队还分析了在表面活性剂或不同DNA损伤剂处理后耐辐射奇球菌的存活率。与野生型菌株相比，ΔJ-like和ΔJ/ΔJ-like均对 tween 20敏感，而ΔJ没有影响；ΔJ与ΔJ-like对H₂O₂和丝裂霉素C（MMC）敏感，ΔJ/ΔJ-like双突变株则表现为更加敏感（图1C）。这些表型表明DrRecJ-like蛋白在细胞应激反应，比如DNA损伤应激和细胞膜应激过程中发挥重要作用。且RecJ和RecJ-like蛋白可能在某些途径中发挥类似的作用，但在另一些途径上具有相互拮抗的作用。

图1 DrRecJ和DrRecJ-like的结构域组成及缺失株表型

接下来，研究团队对ΔJ-like、ΔJ和ΔJ/J-like进行了转录组分析（图2）。Venn图表明，在所有上调的基因中，只有18个基因在三个突变株之间共享，其中编码了一些DNA损伤响应蛋白。相反，在所有下调的基因中，有225个基因在三个突变株之间共享，其中编码了包括多个核糖体蛋白，一些转录/翻译/细胞分裂相关蛋白，以及群体感应和氧化磷酸化相关蛋白。这就解释了为什么这些突变菌株都表现出生长缓慢，并且对一些DNA损伤试剂如H₂O₂和MMC敏感。而对于某些基因，双突变引起的表达差异甚至比各自单突变引起的表达差异更小，说明两蛋白在某些通路上存在拮抗作用。

图2 各菌株的差异表达基因分析

随后，研究团队通过对DrRecJ-like和DrRecJ的底物水解特点的分析，发现DrRecJ-like表现出Mn²⁺偏好的寡核苷酸和环状核苷酸水解活性，而DrRecJ仅对较长的DNA链有水解能力（图3 A）。为了研究DrRecJ-like水解底物的方向性，团队采用无机磷检测试剂盒，对DrRecJ-like 水解pAp，pApA和ApAp的情况做了分析（图3 B），发现DrRecJ-like会优先打断底物3’端的磷酸二酯键，形成ApA和3’P产物，这表明DrRecJ-like拥有3’-5’的底物水解方向（图3 C）。

图3 DrRecJ-like蛋白对底物的水解活性分析

研究团队还通过X射线衍射解析获得了1.97 Å分辨率的结合有Mg离子的DrRecJ-like蛋白结构。DrRecJ-like与已报道的其他细菌的NrnA蛋白有类似的拓扑结构和二聚化状态（图4 A和B）。而上述生化实验也证明了DrRecJ-like具备典型的NrnA活性。通过结构预测和点突变验证的方法找到了DrRecJ-like蛋白上对底物结合和催化非常关键的几个氨基酸（图4 C和D）。

图4 DrRecJ-like结构分析

目前为止报道的NrnA都是呈二聚化状态。从结构上看，DrRecJ-like二聚化是由DHH和DHHA1结构域上几个α-螺旋的疏水相互作用介导的。团队通过多点突变的方法构建了二聚化缺陷的DrRecJ-like蛋白，发现二聚化缺陷会严重影响该蛋白的体内体外功能，从而认为该亚家族蛋白二聚化的意义在于可以通过控制DHH和DHHA1结构域的开合以帮助底物高效结合和水解。由于相应的疏水氨基酸在该家族同源蛋白中非常保守，因此，DrRecJ-like蛋白的二聚化模式及意义可能适用于所有NrnA蛋白。

我校为该论文的第一完成单位，基础医学院程凯莹教授为通讯作者，团队研究生王莹和郝万山为文章的共同第一作者。该研究受到了浙江省医学表观遗传学重点实验室（建设期）的支持，以及国家自然科学基金、浙江省自然科学基金和传染病诊治全国重点实验室自主课题基金的资助。

标签：结构  损伤  基因