引物浓度 引物上的nmol是浓度还是什么

一、引物上的nmol是浓度还是什么

表示某种物质的非常低浓度或含量。nmol值表示一定体积(如1ml)内的物质含量，那么它就是该体积内的浓度，单位是nmol/ml或nmol/L。例如5nmol/ml就是0.000005摩尔/升的浓度。nmol值表示一定质量(如1克)内的物质含量，那么它就是该质量内的含量，单位是nmol/克。例如2nmol/克就是0.000002摩尔含量。nmol是一个非常小的单位，只代表1/10亿的摩尔含量。所以提到的nmol值很可能表示非常低浓度，可以根据实际需求进行换算成更大的单位，例如μmol(micromole，10^-6摩尔)或pmol(picomole，10^-12摩尔)等。

二、pcr要加入什么原料 是否需要RNA引物

引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会.

酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少.

dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性.dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris.HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5,小量分装,-20℃冰冻保存.多次冻融会使dNTP降解.在PCR反应中,dNTP应为50～200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配.浓度过低又会降低PCR产物的产量.dNTP能与Mg2 结合,使游离的Mg2 浓度降低.

模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本. SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸.提取的核酸即可作为模板用于PCR反应.一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增.RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.

Mg2 浓度 Mg2 对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2 浓度为1.5～2.0mmol/L为宜.Mg2 浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少.

PCR反应条件为温度、时间和循环次数.

温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90～95℃变性,再迅速冷却至40～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸.对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性).

①变性温度与时间：变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因.一般情况下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响.此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败.

②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素.变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞.退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度.对于20个核苷酸,G C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想.引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值(解链温度)=4(G C)＋2(A T)

在Tm值允许范围内,选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性.复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合.

③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：

高于90℃时, DNA合成几乎不能进行.

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合.PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的.3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min.延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现.对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些.

循环次数循环次数决定PCR扩增程度.PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度.一般的循环次数选在30～40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多.

特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；

其中引物与模板的正确结合是关键.引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的.聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度.再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高.

灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平.能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌.

简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2～4小时完成扩增反应.扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广.

对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板.可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测. PCR扩增产物分析

PCR产物是否为特异性扩增,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论.PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法.

凝胶电泳分析：PCR产物电泳,EB溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性.PCR产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重PCR,应用多对引物,其产物片断都应符合预讦的大小,这是起码条件.

琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶,供检测用.

聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中,可用于科研及检测分析.

酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究.

分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据,也是检测PCR产物碱基突变的有效方法.

Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针,与PCR产物杂交.此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研.

斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析.

核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可

三、PCR引物浓度一般选多少

1、PCR引物浓度一般选5～20μmol/L。

2、PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2 ）。

3、引物有多种设计方法，由PCR在实验中的目的决定，但基本原则相同。PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。

4、模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制。

5、缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子。

6、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

7、①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

8、②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

9、③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”。

10、而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

四、合成的引物怎么溶解

收到引物后，在开启离心管盖前在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟，以防开盖时引物干粉散失。引物保存在高浓度的状况下比较稳定。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。引物一般配制成10-100pmol/uL(umol/L)。

引物管上标有1OD相当于多少umol的计算结果，进行稀释时的引物加水量可以按以下公式计算：

稀释成100pmol/ul 1OD需加水量（ul）=1OD相当于umol数×10000

例如，您拿到的引物DNA合成报告单上标有1OD≈0.0035umol，包装量是1OD/管，如果您希望将引物浓度定为10umol/L，那么只需用350ul无核酸酶的双蒸水将1OD的引物干粉溶解即可。

◆液体引物再稀释可用下列公式：

稀释引物要达到的浓度（pmol/ul）＝母液浓度（pmol/ul）×汲取母液的体积（ul）÷（汲取母液的体积（ul）＋加水量（ul））

引物一般来的时候是干粉。这种状态能保存最长的时间。

如果用的话要先离心，5分钟（12000转）。然后用它上面写的nmol*1000/你的终浓度=你要加的水量

溶解液有TE和dd水。TE其实就是tris盐酸和EDTA的混合液。理论上用TE保存好，不容易降解。

一般配的时候要先配成储存液（浓度是100umol/L）,在配成使用液（浓度是10umol/L）。这样的好处是引物不容易降解。

引物忌讳反复冻溶，大家要注意。如果你都配成了使用液就应该分装。使用液放在4度（2/3个月没问题的），储存液放在-20度。

引物稀释很简单，一般装引物的管子上都标有引物的量如3.6nmol/OD,可直接往管中加360ul的无菌双蒸水溶解就可以了，在加水之前要先高速离心管子几分钟，加水后要高速漩涡混匀几分钟就可以用了，此时的储存浓度是10umol/L，如果体系是20ul一般加1ul引物(引物的使用浓度最大为10pmol/ul，但一般在0.5-5pmol/ul即可)。

引物的浓度设定，不同的人有不同习惯，有的喜欢稀释成100uM的，有的习惯于稀释成20uM,也有的稀释成10uM的。建议稀释成20uM的浓度，因为如果你稀释成100uM，当你所做PCR的体系不是很大的时候，体积太小了引物就不好加，容易产生误差；如果是稀释成10uM，引物浓度过低，容易降解。不过不管你稀释成多大浓度的，最好分装保存，免得反复冻融容易降解。

五、请问PCR引物浓度是如何设定的

>>>一般都稀释成应用液，常用浓度是10uM/L也就是10pM/L.这样的话，20ul体系加1ul，50ul体系加2ul，方便使用！至于引物会不会降解的问题，估计高浓度比低浓度保存时间长说法是对的。但是，通常引物在20度放半年都没有问题，如果不是经常用，可以先取出一部分来用，其余都放-80度保存，可以放很久。引物稀释很简单，一般装引物的管子上都标有引物的量如3.6nM,你直接往管中加360ul的无菌双蒸水溶解就可以了，在加水之前要先高速离心管子几分钟，加水后要高速漩涡混匀几分钟就可以用了。

六、干粉引物怎么稀释到工作液

先离心！然后加入适量的水或TE溶解。一般配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般终浓度用0.25-0.5pM/μl较好。

1引物的分子量如何计算？比如：AAGCTTTTACCGC的分子量是多少？

2 OD值，1个OD值是不是等于40UG。

3质量数，质量数的含义是什么，怎么计算？

4摩尔数（μmol）和终浓度(pM)和稀释水量（μl）

是不是计算稀释引物都要用到以上四点的各个参数？具体的公式是什么呢？

（以上为近似值，通常都这样用）

因为引物合成后是干粉状的，在运输过程中可能会沾到管壁或管盖上，直接打开有些粉末可能会飘出去，引物的量就减少了。先离心使粉末都到管底，可以避免这种现象的发生。

然后根据以下公式可计算出所加双蒸水的量

是为10pmol/ul浓度的引物溶液,还可以由此推算其它浓度所需的双蒸水量。

订引物回来的说明书背面一般都有引物稀释计算的说明的.

好了，文章到这里就结束啦，如果本次分享的引物浓度和引物上的nmol是浓度还是什么问题对您有所帮助，还望关注下本站哦！

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